所謂實時熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法.

　　1.在熒光定量PCR技術(shù)中,有一個很重要的概念—— Ct值.C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含義是:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(如圖1所示).

　　Ct值的確定

　　2. 熒光域值(threshold)的設(shè)定

　　PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,即:threshold = 10 SDcycle 6-15

　　3. Ct值與起始模板的關(guān)系

　　研究表明,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系〔1〕,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小.利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標(biāo)代表Ct值(如圖2所示).因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù).

　　熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　4. 熒光化學(xué)

　　熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種:熒光探針和熒光染料〔2〕.現(xiàn)將其原理簡述如下:

　　1)TaqMan 熒光探針:PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團.探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步.如圖3所示.

　　TaqMan 熒光探針工作原理

　　2)SYBR熒光染料:

　　在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步.