在進(jìn)行免疫標(biāo)記時(shí)，通常先將種屬特異IgG分子生物索化，顯微鏡并制備生物素或抗生物素蛋白與標(biāo)記物的復(fù)合物，生物顯微鏡利用生物素與抗生物素蛋白間的高親和性反應(yīng)識(shí)別抗原位置。顯微鏡下面是標(biāo)記物與抗生物素蛋白結(jié)合時(shí)免疫標(biāo)記模式圖。

　　此時(shí)，生物顯微鏡二抗不是通過化學(xué)交連而是通過免疫學(xué)反應(yīng)與標(biāo)記物偶連。圖6-3是此法的模式圖。利用不標(biāo)記抗體作為橋分子的主要優(yōu)點(diǎn)是避免了化學(xué)交連對抗體活性可能產(chǎn)生的影響。PAP (Per-oxidase - A nt iperoxidase)法和鐵蛋白一抗鐵蛋白法均屬此例。

　　顯微鏡隨著研究對象(組織、細(xì)胞、順粒)，生物顯微鏡抗原部位(細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞表面，鑲嵌于膜內(nèi))和觀察方法(透射電鏡、掃描電鏡)的不同，顯微鏡免疫標(biāo)記的具體過程也各不相同。本節(jié)將介紹兩種基本的免疫標(biāo)記方法一包埋前法與包埋后法。

　　顯微鏡樣品產(chǎn)生非特異結(jié)合的另一個(gè)來源是Fc受體。掃描電鏡在巨噬細(xì)胞，B-淋巴細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面均有Fc受體.研究這些細(xì)胞的表面抗原時(shí)最好使用Fab或F (ab’):代替完整抗體分子，顯微鏡以避免F。生物顯微鏡段與Fc受體的結(jié)合。

　　抗體不純或效價(jià)太低都可能造成非特異結(jié)合。顯微鏡免疫標(biāo)記時(shí)應(yīng)使用經(jīng)過純化的高效價(jià)抗體。生物顯微鏡方法學(xué)不當(dāng)是造成非特異結(jié)合的顯微鏡最常見的原因.具體說來有下面幾種可能:

　　(1)樣品中的靜電荷未封閉或封閉不全，由于靜電相互作用抗體結(jié)合于樣品。顯微鏡在標(biāo)記前，樣品用1%BSA處理以及在一抗和二抗稀釋液中加入1 %BSA都是為了封閉樣品中的電荷。生物顯微鏡如果效果不佳，顯微鏡可試用0. 5 yo雞蛋清蛋白或二抗種屬的正常(顯微鏡未經(jīng)免疫的)血清(10%)或脫脂奶粉((200"4%)代替BSA.

　　(2)經(jīng)醛類固定后樣品中游離醛基未封閉。生物顯微鏡醛類固定后，掃描電鏡樣品經(jīng)0.5mo1/L NH,CI處理是免疫電鏡樣品制備的必要步驟。顯微鏡有時(shí)也可用0.05mol/L的賴氨酸或甘氨酸代替NH,C1.